3年經驗總結！新冠檢測實驗室，核酸氣溶膠污染避坑指南！
發布時間：2022-11-17 09:06:13
核酸檢測實驗室想完全杜絕核酸污染是不可能的。核酸檢測實驗室的管理者和實驗人員必須要認識到核酸污染是不可避免的，但是污染的頻率和概率是可控的。我們要做的是時刻保持警惕，盡最大努力將污染的概率降到最低，并且能第一時間發現污染并及時進行處理。
當地時間２０２０年４月１８日，《華盛頓郵報》（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｐｏｓｔ）爆了一則重磅新聞，美國ＣＤＣ在實驗室生產的新冠病毒檢測試劑出現了污染問題，導致全美的核酸檢測推遲最少一個月。１月２１日，ＣＤＣ已經“確定開發”了新冠病毒的檢測方法，并使用它來確認美國的第一例新冠病例，１月下旬，美國ＣＤＣ對２６個公共衛生實驗室發放新冠病毒試劑盒，有２４個實驗室出現了假陽性反應。ＣＤＣ緊急召回了診斷試劑，直到３月２日，ＣＤＣ的新冠病毒試劑由Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＩＤＴ公司生產重新投入使用。這起實驗室污染的代價是美國錯過了黃金的疫情防控窗口，數萬甚至數十萬普通民眾死亡。每一個實驗室都應該把這個教訓銘記在心，時刻提醒自己，核酸污染隨時都可能發生，無論什么級別的實驗室都可能發生。較常見，發生概率在４０％～６０％之間；以重組質粒作為陽性質控品，發生污染的概率更大；以構建的假病毒或重組病毒作為陽性質控品，參與核酸提取的過程中，也容易發生氣溶膠污染；在試劑的配制過程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液，核酸氣溶膠等，導致試劑被污染。筆者認為，這是目前實驗室引起的核酸污染最主要原因！尤其是是第一代ＰＣＲ技術，發生概率在６０％以上；ＰＣＲ產物經反復多次的擴增，其復制量遠遠超過ＰＣＲ的檢測極限。
一個氣溶膠所包含的拷貝數可以在１０４～１０６ｃｏｐｉｅｓ，因此即使是極微量的污染也足以造成實驗結果假陽性。
但是，在采用了ＵＮＧ／ＵＤＧ防污染的ＰＣＲ產品中，擴增產物引起的污染概率降至１０％左右。
ＰＣＲ擴增管的密封性是預防擴增產物污染的關鍵。如果密封不嚴，擴增完成后有蒸發現象，液面不整齊，或者擴增過程中有“炸管”聲音。
放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴導致樣品與外界接觸被污染；待提取樣本中含有強陽性樣本，其提取的樣品中含有高濃度的陽性核酸，形成氣溶膠造成污染。氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產生的。開蓋、晃動、加樣器的反復抽吸等開放式操作，形成核酸氣溶膠從而導致核酸污染。以上核酸污染來源，均可形成氣溶膠擴散至空氣中，或直接吸附到物體表面。因此，應尤其重視由氣溶膠導致污染的問題。重度污染假陽性的ｃｔ值可在２４左右，中度污染ｃｔ值在３０左右；輕度污染ｃｔ值在３３左右。１、空氣中的核酸氣溶膠污染物：彌散到實驗室各個角落，比較棘手；２、物表的核酸污染物：移液器、離心機、核酸提取儀、傳遞窗、ＰＣＲ儀、拆開的試劑盒、槍頭盒、打開的耗材等表面。嚴格的ＰＣＲ實驗室應有標準的正負壓系統及四分區（或三分區），實驗室應按照生物安全二級實驗室及ＰＣＲ實驗室設計基本要求來建設。可參考的標準為《ＧＢ５０３４６－２０１１建設標準生物安全實驗室建筑技術規范》及衛健委下發的《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》。醫療口的實驗室大多符合要求，在科研口和農業口的實驗室應重視實驗室的規范性建設！軟件配置應按照衛健委相關技術文件規定，人員配置應專區專人，人員不可不同分區混用，物流、人流、氣流做到單向流動！臨床上，門診的新冠快檢ＰＣＲ實驗室（或免提取方法）多半不規范。沒有嚴格按照標準ＰＣＲ實驗室建設，更加容易發生污染。三分區（或二分區）、緩沖間、正負壓、人員配置２人以上，這些基本要求沒有達到，更加容易發生氣溶膠污染。現有技術指導原則，只要求了選擇ＢＳＬ－Ⅱ級生物安全柜，但并未規定具體型號。從臨床經驗來看，只有Ｂ２型生物安全柜可以用于加核酸模板。Ａ１型、Ａ２型、Ｂ１型，循環風很容易造成核酸氣溶膠的形成，從而造成污染，且污染很難清除。Ｂ２型為全排放，無循環風，可以用于加核酸模板。
紫外燈能殺滅病毒，但是《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》指出，短片段的基因核酸對紫外線損傷不敏感。常規消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類、季銨鹽等雖然能殺菌，但是不能降解核酸，或降解效率較差。尤其是酒精，它其實是核酸提取試劑中的一個組分，對核酸沒有任何降解作用。已知的消毒劑中，次氯酸鹽類消毒劑可以一定程度的降解核酸，但是腐蝕性強，不能處理精密儀器及金屬制品，容易腐蝕移液器吸桿影響ｔｉｐ頭氣密性。吸取陽性對照（質粒）沒有遵循“慢吸快打”的原則（這個需要練習形成“肌肉記憶”），新手往往是“快吸快打”，造成陽性樣品污染槍頭，或者在生物安全柜循環風的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區域。應使用帶有濾芯的槍頭。
帶濾芯槍頭
４．２ 加樣區沒有放置臺面垃圾桶：應把加完樣的ｔｉｐ槍頭，丟入含有次氯酸溶液的加蓋垃圾桶中。因為次氯酸容易揮發，因此應每天都要更換含氯消毒液！
桌面垃圾桶（利器盒）
在筆者的臨床實踐中，發現以下區域存在陽性污染的概率更大：
生物安全柜＞核酸提取儀＞移液器＞ＰＣＲ擴增儀（ＰＣＲ管密封性）＞離心機；陽性質控品＞強陽性樣本＞ＰＣＲ擴增產物（無ＵＮＧ技術）＞ＰＣＲ擴增產物（ＵＮＧ技術），ＰＣＲ管密封性是擴增產物是否引起污染的關鍵。如同，幸福的家庭都一樣，不幸的家庭各有各的不幸。同理，規范的實驗室都一樣，污染的實驗室各有各染情況。以上數據僅供參考。核酸檢測實驗室的布局是預防污染的根本，合理布局可以大大降低污染的概率。一般情況分為四個區分別為試劑準備區，標本制備區、核酸擴增區和產物分析區。對于不需要電泳的熒光定量ＰＣＲ，核酸擴增區和產物分析區可以合并。每個區應獨立通風，可控制空氣流動方向。有些核酸檢測實驗室在實驗室建設時未考慮到核酸擴增需求，就是按照普通實驗室建設。這種情況下，個人建議擴增和產物分析區應遠離試劑準備區和標本制備區，盡量不在一個樓層或者不在一個區域。最忌諱的是幾個實驗室緊挨著，甚至門對門。另外建議廢棄物處理的房間也要遠離以上實驗室，避免廢棄物處理過程中產生的污染。四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區（簡稱擴增區）至產物分析區，避免發生交叉污染。再好的實驗室設計，如果實驗人員不遵守規程，一切都是徒勞的。加強實驗室人員的培訓和管理至關重要。陰性質控：實驗室的核酸污染風險跟檢測量正相關，因此在檢測活動比較頻繁時需要多添加陰性質控，包括陰性樣品，陰性提取對照，陰性擴增對照，無模板對照，甚至可以使用反應體系，引物探針和提取試劑等作為對照以檢驗檢測流程和反應系統組分的污染。陰性對照可以使用幾個隨機插入檢測樣品。保證出現污染可以第一時間發現。有一些規范建議ＰＣＲ產物使用１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸浸泡，我認為這極易造成ＰＣＲ產物的暴露和擴散，具有很高的風險。還有一些實驗室從生物安全的角度將所有的實驗廢棄物全部高壓，我也是不建議的，因為ＰＣＲ產物沒有生物安全風險，高壓會造成ＰＣＲ產物擴散，對實驗室的污染風險更高。個人建議對于ＰＣＲ產物，進行表面消毒后按照普通醫療廢棄物處理即可。對于一般的核酸檢測實驗室，推薦使用封閉擴增的熒光定量ＰＣＲ方法進行核酸檢測。不推薦使用普通ＰＣＲ方法和巢氏ＰＣＲ，使用這兩種方法實驗室污染是大概率事件。謹慎使用等溫擴增的方法，等溫擴增的酶反應效率更高，產物中模板含量也更高，污染的概率也會提高。操作核酸時動作要輕柔，移液器吸液慢吸慢放，開管蓋要慢慢開，避免操作產生氣溶膠。使用渦動混勻后，稍稍靜置一會再開管蓋，推薦使用移液器緩慢吹吸混勻。其原理是用ｄＵＴＰ 代替ｄＴＴＰ，使產物中摻入大量ｄＵ。在再次進行ＰＣＲ 擴增前，用ＵＮＧ 處理ＰＣＲ 混合液即可消除ＰＣＲ 產物的殘留污染。由于ＵＮＧ 在ＰＣＲ 循環中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含ｄＵ 的新的ＰＣＲ 產物。所有試驗物品盡可能分裝成小包裝：耗材開包后分裝成一周使用量，用自封袋封好。試劑也盡可能購買小包裝或者回實驗室分裝，實驗中經常用到配液的水尤其需要分裝。實驗中所有吸頭都應使用帶濾芯的吸頭。發現污染第一步就是要暫停實驗，評估假陽性對以往檢測結果的影響。對實驗進行徹底打掃和清理，盡可能更換相關的試劑耗材，對儀器設備進行清潔和去核酸處理。所有人員回家洗澡換衣服。使用商品化的ＤＮＡ去除劑，有好用的ＤＮＡ去除劑大家可以推薦給我１ ｍｏｌ／ｌ的 鹽酸和各種化學物質去降解ＤＮＡ。停下所有實驗，靠風和時間抹掉核酸的痕跡。這是我最常用的方法，通風是最有效的方式。如果是擴增產物污染，在不去除污染的情況下仍然可以進行檢測。方法是使用另一種方法或試劑盒，只要兩種試劑的擴增產物不一致，沒有交叉反應，仍然可以繼續試驗。但是這種方法要進行測試，我并不推薦這么做。移液器內部被污染很難去除，可以通過清洗或者另換一套移液器。移除內部所有物品，用ＤＮＡ去除劑擦拭表面后，打開柜門連續運行。用ＤＮＡ去除劑擦拭內表面后，打開提取儀門或外罩，靜置。如果能及時發現污染，通常情況不會太嚴重，采取上述措施實驗室空置幾天污染會消除。但是如果發生了很嚴重的污染，采取上述措施污染仍不能消除，就只能把一切交給時間了。
（文章來源于互聯網）
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